单细胞类型注释：把 marker、图和判断写进同一份记录

10x 单细胞分析入门 · 第 09 篇

聚类有了编号，还没有细胞类型。这里先计算候选 marker，再看组合表达，最后把“类型”和“依据”写入表格，按聚类 ID 匹配回对象。

输入是 results/03-clustered.rds。本篇完成的是 PBMC 的教学性人工注释，不包含已独立验证的参考映射，也不会宣称把全部细胞亚型准确分完。判断不足的群可以保留 Unknown，但要写出尚缺的证据。

先生成 marker 和注释模板

cd ~/sc-course
Rscript scripts/04-markers.R "$PWD" > logs/04-markers.log 2>&1
echo $?
head -n 6 results/04-top10-markers.csv
cat results/04-annotation.tsv

脚本输出完整候选表、每群前 10 个候选、marker DotPlot、4 个基因的 FeaturePlot，并生成 04-annotation.tsv。重复运行不会覆盖已经存在的人工注释表。

核心调用如下：

library(Seurat)
pbmc <- readRDS("~/sc-course/results/03-clustered.rds")
Idents(pbmc) <- factor(pbmc$cluster_res_0_5,
                       levels = sort(unique(pbmc$cluster_res_0_5)))
markers <- FindAllMarkers(pbmc, assay = "RNA", only.pos = TRUE,
                           test.use = "wilcox", min.pct = 0.25,
                           logfc.threshold = 0.25, random.seed = 42)

这是按当前聚类区分表达特征，帮助命名细胞群。它不是疾病与对照之间、以供体为单位的差异表达检验。候选 marker 和正式条件差异不能只换个输出文件名就互相替代。

表中每列怎样帮助判断

列	用法	容易误读的地方
gene	候选特征名称	第一名不一定最有生物学特异性
avg_log2FC	群间表达差异的方向与幅度	不是该基因的绝对表达量
pct.1 / pct.2	目标群和其余细胞的检出比例	少量细胞的强表达可能抬高均值
p_val_adj	该次候选检验的校正结果	极小 P 值不能替代类型证据

本例按 log fold change 和检出比例排序展示候选，不将这份前十名列表当作固定 marker 数据库。参数含义以 FindAllMarkers 文档为准。

用组合 marker，而不是只找一个阳性基因

下面是本例的核查面板，作为检查起点，不能跨组织直接套用：

候选群	先看哪些基因	还要排查什么
T 细胞	CD3D、CD3E；结合 IL7R、CCR7、CD8A	不凭 NKG7 单独把细胞毒性 T 细胞叫 NK
B 细胞	MS4A1、CD79A	低表达或少数阳性是否足够支持整群命名
单核细胞	LYZ，结合 S100A8、FCGR3A、MS4A7	FCGR3A 也可能出现在其他群，需要组合证据
NK 候选	NKG7、GNLY，结合 CD3 基因	T/NK 边界和低测序深度造成的漏检
树突细胞候选	FCER1A、CST3	稀有群规模、与单核细胞的关系
血小板相关候选	PPBP、PF4	背景 RNA、少量细胞和混合信号

这一面板基于 PBMC 常用表达特征及Seurat PBMC 示例中的注释参考，本文把它变成待核对的证据组合，不预先把所有群定死。

DotPlot(pbmc, features = c("CD3D", "MS4A1", "CD79A", "LYZ", "NKG7", "GNLY")) +
  RotatedAxis()
FeaturePlot(pbmc, features = c("CD3D", "MS4A1", "LYZ", "NKG7"), ncol = 2)

DotPlot 的点大小与颜色表达不同信息，具体以图例和 DotPlot 文档核对。颜色按特征缩放后，不能拿不同基因间的颜色深浅直接比较绝对表达。

由配套脚本实际绘制。可对照 4 群与 6 群：都有细胞毒相关信号，但 CD3 与 GNLY 的组合不同；不能只凭 NKG7 就把两群都命名为 NK。

填写注释表，保留不确定项

打开 results/04-annotation.tsv。保持制表符分隔，每个聚类只出现一行。下列是填写方式示意，编号 example 不是本例的真实聚类 ID：

cluster	cell_type	evidence
example	T_candidate	CD3D/CD3E enriched; subtype unresolved

配套提供本次运行的注释参考。先对照当前的聚类大小、marker 和图，再决定是否采用。换了版本、阈值或随机种子后，编号可能变，不能整表盲拷。

本次聚类	细胞数	教学注释	判断保留到哪一级
0	655	T_CCR7	CCR7/LEF1/TCF7 支持的 T 细胞状态，不把标签当作已验证亚型
1	485	T_IL7R	IL7R/CD40LG 等支持的 T 细胞状态
2	480	CD14_monocyte	LYZ/S100A8/S100A9/CD14 支持的单核细胞群
3	344	B_cell	MS4A1/CD79A 等支持的 B 细胞群
4	322	Cytotoxic_T	结合 CD3、CD8A 和细胞毒相关表达
5	162	FCGR3A_monocyte	结合 LYZ、FCGR3A、MS4A7 等
6	144	NK_candidate	结合 GNLY/NKG7 与较低 CD3 信号，保留候选表述
7	32	DC_candidate	FCER1A/CD1C/CLEC10A 支持，小群保留候选表述
8	14	Platelet_related	PPBP/PF4/GP9/ITGA2B 支持的血小板相关信号，仍需排查背景与混合

本次输出 3,426 行候选 marker。行数依赖检验参数和版本，不是正确运行的通用标准。表中的类型均是当前案例的人工教学判断，没有独立实验验证。

证据可以包括支持 marker、冲突信号、低置信度原因。若暂时无法确定，可写 Unknown 并说明原因，例如“cluster too small; mixed lineage markers”。模板中的 pending review 必须替换，否则最终脚本会停止。

按 ID 匹配回对象

Rscript scripts/05-annotate.R "$PWD" > logs/05-annotate.log 2>&1
echo $?
cat logs/05-annotate.log

脚本会检查重复聚类 ID、缺失行、空类型和未填写依据。通过后按 match 匹配，而不是按表格行号赋值。它保留原有 cluster_res_0_5，另外新增 cell_type 与 annotation_evidence。

成功后有 05-annotated.rds、05-cell-metadata.csv、05-cell-type-counts.csv 和 05-cell-types.png。检查类型数量表，确认没有因为拼写差异将一个类型拆成两个名字。

最后做两项复核

第一，把注释表行顺序打乱，保存后重跑最终脚本。结果应仍按聚类 ID 对齐，细胞类型数量不变。第二，给同一聚类重复一行，脚本应报错停止。练习结束后恢复正确的表。

两项检查帮助确认元数据处理没有依赖“碰巧正确”的行顺序；它们不能证明人工类型判断正确。生物学复核仍要结合组织来源、更多特征、必要的参考映射和实验信息。

当前单样本练习到这里完成。将目录中的交付文件清单逐项核对后，再开始设计多供体比较，避免把单供体教学结果写成组间研究结论。